Na przekór tradycji: stare dobre sposoby nie zawsze są dobre

Fluorescencja jest dobrze znanym i badanym od dziesięcioleci zjawiskiem o wielu praktycznych zastosowaniach. Pomimo tego, pewien formalizm matematyczny powszechnie stosowany do opisu zaniku fluorescencji w niektórych sytuacjach nie ma sensu fizycznego, co pokazali niedawno naukowcy z Instytutu Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk. Wykazali oni mianowicie, że równania, które mogą być bezpiecznie stosowane w przypadku ciał stałych, gdzie cząsteczki są praktycznie nieruchome, nie zawsze mogą być użyte w przypadku opisu zaniku fluorescencji w cieczach, gdzie molekuły mogą się swobodnie poruszać. Co więcej, jeśli to powszechnie stosowane podejście zostanie użyte nieprawidłowo, może prowadzić do niewłaściwej interpretacji danych eksperymentalnych i tym samym do błędnych wniosków. Właśnie przed tym ostrzega ich najnowszy artykuł w Journal of Chemical Physics.

Wszystko świeci, ale nie w ten sam sposób. Od ponad wieku wiadomo, że każda substancja w określonej temperaturze powyżej temperatury zera bezwzględnego emituje fotony. Niektóre substancje emitują również światło w wyniku reakcji chemicznej lub biochemicznej, reakcji elektrochemicznej lub po wzbudzeniu przez inne źródło światła. Zjawiska te znane są odpowiednio jako chemi-, bio-, elektrochemi- i fotoluminescencja. Być może Czytelniku widziałeś nocne zdjęcia australijskich wybrzeży pełnych mieniących się od jasnoniebieskich alg lub zdjęcia świetlików migoczących jasnym światłem na tle nocnego nieba lesie. A może zauważyłeś zielone i niebieskie symbole mieniące się banknotach podczas ich naświetlania lampą ultrafioletową? To tajemnicze świecenie to nic innego niż proces zwany luminescencją, w którym po wzbudzeniu cząsteczki oddaje ona nadmiar energii w postaci fotonów, a nie tylko ogrzewając swoje otoczenie. Powrót wzbudzonych elektronów z wyższych poziomów energetycznych do niższych oznacza więc emisję światła.

Zjawisko luminescencji zostało po raz pierwszy opisane w Europie w XVI wieku przez Nicolasa de Monardes. Miał on szczęście otrzymać z Meksyku próbki drewna, które po namoczeniu w wodzie alkalicznej świeciły na niebiesko. Rdzenni Amerykanie od dawna wiedzieli, że to spektakularne zjawisko jest oznaką dobrze przygotowanego leku przeciw chorobom nerek z pewnej rośliny znanej Monardesowi jako Lignum nephriticum. Obecnie luminescencja, a w szczególności fluorescencja, jest intensywnie wykorzystywana w tym samym celu, czyli badania struktury i określonych właściwości próbek biologicznych. Co więcej, techniki mikroskopii fluorescencyjnej rozwinęły się do tego stopnia, że obecnie możemy obserwować nawet pojedyncze cząsteczki emitujące światło.

Interesującą cechą próbek fluorescencyjnych jest to, że czas trwania emisji światła zależy od wielu czynników zewnętrznych. Dlatego w badaniach tego zjawiska  wykorzystywany jest nie tylko kolor światła, ale także czas zaniku fluorescencji. W najprostszym przypadku ten zanik jest dobrze opisany przez funkcję wykładniczą, analogicznie do wykładniczego zaniku intensywności promieniowania jonizującego (alfa, beta lub gamma) emitowanego przez próbkę zawierającą jeden rodzaj izotopu promieniotwórczego.

Często obserwuje się, że gdy próbka ma złożoną strukturę, jest niejednorodna lub bardzo lepka, prosta funkcja matematyczna jak choćby właśnie funkcja wykładnicza nie jest wystarczająca do opisania czasowej zmiany fluorescencji i konieczna jest suma kilku takich funkcji, z różnymi wartościami stałych szybkości zaniku fluorescencji. Jeśli jednak układ fizyczny jest jeszcze bardziej złożony, to, zamiast sumować jeszcze większą ilość funkcji wykładniczych, prościej jest zastosować ciągły rozkład stałych zaniku będących odwrotnością „czasu życia”, czyli średniego czasu przebywania cząsteczki w stanie wzbudzonym.

Jest to bardzo elegancki formalizm matematyczny, dający wgląd w zawiłą naturę fluorescencji w różnych środowiskach. Przykładowo, w żywej komórce fluorofor może znajdować się w błonie, cytoplazmie, mitochondriach lub być przyczepiony do niektórych białek... Wszystkie te różne środowiska wpływają na właściwości fluoroforu,  prowadząc do nieco innych kolorów luminescencji z różnymi czasami zaniku procesu świecenia.

Jednym z ważnych zjawisk występujących w przypadku wzbudzonych cząsteczek jest tzw. wygaszanie. Zwykle jest to reakcja chemiczna, która zmniejsza intensywność światła emitowanego przez określoną próbkę. Skraca to również obserwowany czas świecenia fluorescencyjnego: mówi się wtedy, że wygaszanie wpływa na kinetykę zaniku fluorescencji.

Połączenie obu tych scenariuszy, czyli uwzględnienie zarówno złożonego otoczenia molekuły, jak i wygaszania fluorescencji przez reakcje chemiczne z innymi substancjami (tzw. wygaszaczami), nie jest łatwe do zbadania, ale w praktyce spotykamy się z nim bardzo często. Można by pokusić się o użycie tych samych sum funkcji wykładniczych lub ciągłych rozkładów czasów życia do wyjaśnienia obserwacji również i w tym przypadku. Do tej pory nie wiedzieliśmy, że podejście takie może być błędne:

„...wykazaliśmy, że to matematyczne podejście ma jasną fizyczną interpretację tylko wtedy, gdy cząsteczki fluoroforu i wygaszacza można z dobrym przybliżeniem uważać za nieruchome, jak w ma to miejsce w ciele stałym. Jeśli jednak weźmiemy pod uwagę możliwość ruchu fluoroforu względem wygaszacza, taka interpretacja staje się niemożliwa. Stąd, w przypadku układów, w których nie można zignorować względnego ruchu fluoroforów i wygaszaczy, nie jest właściwe stosowanie niezależnych od czasu rozkładów szybkości lub czasu zaniku w celu wyjaśnienia, dopasowania lub zracjonalizowania wyników eksperymentalnych dotyczących zaniku fluorescencji”. - mówi prof. Gonzalo Angulo z IChF PAN.

Ponadto, naukowcy IChF PAN przedstawili nowe podejście do mikroskopowego opisu układów molekularnych, w których uwzględniono względny ruch fluoroforu i wygaszacza. Wykazali, że możliwe jest zastosowanie tego podejścia teoretycznego do przewidywania postaci rozkładu szybkości rozpadu, pod warunkiem, że znane są początkowe warunki procesu, takie jak rozkład wygaszaczy wokół fluoroforu i mikroskopowe szybkości transferu energii lub elektronów między molekułami. Taki rozkład może poprawnie opisywać zanik fluorescencji nawet w obecności ruchu molekuł, ale – w przeciwieństwie do standardowego podejścia –   jest zmienny w czasie.

Jak to zwykle bywa w badaniach teoretycznych, przyjęto kilka upraszczających założeń:

„Po pierwsze, założyliśmy, że wygaszacze oddziałują z fluoroforem, ale nie »czują« siebie nawzajem, więc ich oddziaływania zostały pominięte. Ponadto, chociaż wzięliśmy pod uwagę objętość molekuł fluoroforu i wygaszacza — zaniedbaliśmy efekt tzw. objętości wykluczonej dla pary wygaszacz-wygaszacz. Dlatego możemy założyć, że położenia cząsteczek wygaszacza są niezależne”. - wskazuje dr Jakub Jędrak. Podkreśla jednak, że najważniejszy wniosek jest bardzo ogólny i nie zależy od obecności, ani od dokładnej formy oddziaływań między cząsteczkami w roztworze.

Wyniki naukowców z IChF PAN pokazują, jak ważne jest ponowne analizowanie istniejących teorii i modeli oraz uważne przyglądanie się pozornie dobrze zbadanym założeniom. Jest więc jeszcze wiele do zrobienia, nawet jeśli uważamy, że wszystko jest doskonale znane.

Badania opisane w J. Chem. Phys. uzyskały dofinansowanie z Narodowego Centrum Nauki w ramach grantu OPUS Nr 2019/33/B/ST4/01443.

KONTAKT:

Prof. Gonzalo Angulo
Instytut Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk
Tel.: +48 22 343 1086
e-mail: gangulo@ichf.edu.pl

ARTYKUŁ:

"Limitations of the rate-distribution formalism in describing luminescence quenching in the presence of diffusion”
Jakub Jędrak, Gonzalo Angulo
J.Chem. Phys. 161, 2024, 104112
https://doi.org/10.1063/5.0223438